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[Real time PCR] 실시간 중합효소연쇄반응 Start

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1. Real time PCR (=qPCR;quantitative PCR)

: Real time PCR(실시간 PCR)은 사이클마다 증폭된 산물의 양을 실시간으로 정량 확인하는 실험법

: 일반적으로 유전자 발현을 측정하는 데 사용

: 미세한 발현 변화를 탐지에는 효과적이지만, 대규모 RNA 연구에는 적합하지 않음

→대규모 RNA 연구는 Microarray 또는 RNAseq 추천

: Real time PCR은 타겟하는 유전자 서열이 필요하기에, 알려진 유전자 연구만 가능함

2. Real time PCR 과정

1) 역전사(Reverse transcription)를 통해, RNA를 cDNA(complementary DNA)로 변환

2) 특정 유전자를 증폭하고 탐지하기 위해, Fluorescent reporter 및 PCR 반응을 사용

*Fluorescent reporter

-SYBR Green probe: 형광을 띠는 삽입 물질인 SYBR Green을 넣고 PCR 수행

-Taqman probe: 형광물질과 형광활성억제물질이 끝에 붙은 탐침으로 PCR 수행

3) SYBR Green probe 또는 Taqman probe를 사용하여, 증폭 산물을 실시간으로 정량함

[Real time PCR] 실시간 중합효소연쇄반응 End

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[Chromatography] 크로마토그래피 Start

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크로마토그래피 (Chromatography)

: 혼합물을 이동상(Mobile phase)에 녹여 고정상(Stationary phase;정지상)에 흘렸을 때, 고정상과 상호작용하는 힘으로 혼합물을 분리하는 기술

: 각 물질의 이동 능력은 고유한 분배 계수(Partition coefficient) 차이로 설명 가능함

: 물질분리/과학수사/도핑테스트/원산지추적/질병조기진단 등 여러 분야에서 사용됨

: 이동상 또는 고정상의 특성에 따라 다양한 종류의 크로마토그래피들이 존재함

1) 컬럼 크로마토그래피 (Column Chromatography)

2) 겔 여과 크로마토그래피 (Gel-filtration chromatography)

3) 이온 교환 크로마토그래피 (Ion-exchange chromatography)

4) 친화성 크로마토그래피 (Affinity Chromatography)

5) 박층 크로마토그래피 (Thin-layer Chromatography)

1. 컬럼 크로마토그래피 (Column Chromatography)

: 컬럼(관) 크로마토그래피는 고정상 용기가 관모양인 크로마토그래피 기법

: 특정한 고정상을 긴 Column에 채우고[, 이 안으로 이동상을 밀어넣는 방식을 취함

: 고정상을 채운 관을 이동상이 내려가는 정도를 계산하여 각 물질을 분류

: 이동상과 고정상의 상호 친화도에 따라 분류 속도가 결정

2. 겔 여과 크로마토그래피 (Gel-filtration chromatography)

: 겔 여과 크로마토그래피(=크기 배제 크로마토그래피;Size-exclusion chromatography)는 물질 크기에 따른 컬럼 통과 속도를 이용한 크로마토그래피

[Chromatography] 크로마토그래피 End

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[Gene cloning] 유전자클로닝 Start

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1. 유전자클로닝 (DNA클로닝;유전자재조합기술)

: 관심 있는 유전자 절편을 벡터에 삽입 후, 세포에 주입하여 발현시키는 유전자재조합 기술 (Recombinant DNA technology)

: 쉽게 말해, 타겟하는 유전자의 동일한 사본을 세포 내에 보관하고 증폭하는 기술

: 형질전환된 생물에서 특정 유전자를 발현시켜 유용한 물질을 대량 생산할 수 있음

→ 인간 인슐린 유전자를 E. coli 박테리아에서 발현시켜 당뇨병 환자를 위한 인슐린 대량 생산

2. 유전자클로닝 준비

ㄱ) 제한효소 (Restriction enzyme)

3. 유전자클로닝 과정

1) 유전자를 자르고 이어붙이기

- 관심 있는 유전자 서열을 PCR로 증폭함

- 제한효소를 통해, 벡터 플라스미드의 Multicloning site 확보

- DNA연결효소를 통해, 플라스미드와 타겟유전자 서열 연결

2) 박테리아 형질전환 및 선별

- 절편이 연결된 벡터 플라스미드를 박테리아에 주입 (형질전환)

*열충격(Heat shock), 전기천공법(Electroporation)

- 항생제가 놓인 고체배지에 박테리아를 뿌려서 플라스미드를 지닌 균주만 선택 (콜로니 선별)

3) 단백질(결과물) 대량 생산

- 플라스미드를 지닌 콜로니를 계속해서 성장시킴

- 성장한 박테리아는 주입된 유전자를 과발현하여 단백질 생산

*Gene → mRNA → Protein

[Gene cloning] 유전자클로닝 End

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[Intrauterine Insemination] 인공수정 Start

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1. 인공수정 (Intrauterine Insemination;IUI)

: 인공수정(자궁 내 수정;Intrauterine Insemination;IUI)은 수정을 촉진하기 위해, 여성 자궁 안에 정자를 직접 주입하는 불임 치료 방법

*정자를 채취하고 활동성을 강화하여, 직접 자궁에 투여함(체내인공수정)

: IUI 과정으로 여성의 나팔관(수란관)에 도달하는 정자수를 늘리고 수정 가능성을 높임

: IUI를 통한 임신율은 3개월 내에 50%, 6개월 내에 90% 정도로 알려짐

: 보통 4회까지 시행으로 임신되지 않으면, 시험관 아기 시술(In Vitro Fertilization-Embryo Transfer;IVF) 진행

*시험관아기시술(체외인공수정) - 과배란 난자 채취 후, 시험관에서 정자와 수정시켜 포배기까지 키워 자궁에 착상시킴

2. 인공수정 이유

ㄱ) 정자수가 적거나 활동성이 떨어진 경우

ㄴ) 원인불명 불임(Unexplained infertility)

ㄷ) 자궁내막증 관련 불임(Endometriosis-related infertility)

ㄹ) 자궁경부 불임(Cervical factor infertility)

ㅁ) 배란요인 불임(Ovulatory factor infertility)

ㅂ) 정액 알러지(Semen allergy)

ㅅ) 사정 부전(Ejaculation dysfunction)

#IUI 인공수정은 아래 환자들에게 추천되지 않음

1) 나팔관(수란관)에 중증 질환을 가진 여성

2) 골반 감염 병력을 가진 여성

3) 심각한 자궁내막증을 가진 여성

3. 인공수정 위험

: IUI는 비교적 간단하고 안전한 방법이지만, 간혹 합병증의 부작용을 보임

a) Infection - 시술 과정에서 발생하는 감염의 위험

b) Spotting - 자궁 내 카테터 삽입시 질 출혈 발생

c) OHSS -  Ovarian hyperstimulation syndrome(난소과자극 증후군)

d) Multiple pregnancy - 과배란 유도 부작용으로 쌍둥이(Twins) 임신 확률 증가

#쌍둥이(Twins)

1) 일란성 쌍둥이(Identical twins)

- 한 개 수정란이 발생 과정 중에 나뉘어서 각각의 배아로 발달하는 경우

- 유전자가 서로 완벽하게 일치함

2) 이란성 쌍둥이(Fraternal twins)

- 두 개 난자가 동시에 배란되어 수정되는 경우

- 유전적으로 동일할 확률이 극도로 낮음

[Intrauterine Insemination] 인공수정 End

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[Dialysis] 인공투석 Start

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0. 인공투석 (Artificial dialysis)

: 인공적으로 체액의 염 균형을 유지하고 혈액중의 노폐물을 제거하여, 깨끗한 혈액을 다시 체내에 공급하는 방법

: 투석액의 용질 농도에 따라, 체액과의 물질 교환이 이루어짐

- 단백질은 반투막을 통과하지 못하고, 노폐물들은 확산되어 제거됨

- 투석액의 조성에 따라 이온, 당 등의 확산을 조절 가능

- 레닌, 비타민D 등은 따로 투여해야 함

2) 복막투석(Peritoneal dialysis)

1. 혈액투석 (Hemodialysis)

: 환자 혈액을 투석기(인공신장기)에 통과시켜 반투막 여과한 다음, 이 혈액을 다시 환자 혈관에 넣어주는 방법

: 항응고제인 헤파린을 투여해서 혈액 응고를 막음

: 말기 신부전환자에 주로 사용

[Dialysis] 인공투석 End

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[ELISA] 효소결합면역흡착검사 Start

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0. ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay)?

: 효소결합면역흡착검사(ELISA)는 항체/항원에 효소를 표지 후, 효소 활성 측정으로 항원-항체 반응 정도를 측정하는 방법

1) Direct ELISA

2) Indirect ELISA

3) Sandwich ELISA

4) Competitive ELISA

1. 직접(Direct) ELISA

: 항원과 반응하는 항체(1차 항체)에 바로 효소를 결합하는 방법

ㄱ) 타겟 항원을 튜브 바닥에 고정함

ㄴ) 효소가 부착된 항체를 투여해서 튜브 바닥의 항원과 붙게 함

ㄷ) 결합하지 않은 항체를 씻어냄

ㄹ) 기질(Substrate)을 첨가해, 효소 발색 반응으로 항원 양을 측정함

▶장점 - 최소한의 과정으로 실험 진행

▶단점 - 모든 1차 항체를 표지하므로 비용이 높음

2. 간접(Indirect) ELISA

: 항원과 결합하는 항체(1차 항체) 대신, 그 항체와 결합하는 항체(2차 항체)에 효소를 결합하는 방법

ㄱ) 타겟 항원을 튜브 바닥에 고정함

ㄴ) 1차 항체를 투여해 항원과 붙게 함

ㄷ) 결합하지 않은 항체를 씻어냄

ㄹ) 효소가 부착된 2차 항체를 투여해, 1차 항체 Fc region에 붙게 함

ㅁ) 기질(Substrate)을 첨가해, 효소 발색 반응으로 특정 항원에 대한 항체를 정량 확인

▶장점 - 2차 항체로 신호 증폭 가능

▶단점 - 교차 반응성 존재

3. 샌드위치(Sandwich) ELISA

: 항원에 대한 항체를 바닥에 먼저 결합 후, 그 항체에 대한 항원을 결합하는 방법

ㄱ) 포획 항체를 튜브 바닥에 고정함

ㄴ) 고정된 포획 항체 위에 항원을 투여해 붙게 함

ㄷ) 결합하지 않은 항원을 씻어냄

ㄹ) 효소 부착된 검출 항체를 위에 뿌려 항원에 붙게 함

ㅁ) 기질(Substrate)을 첨가해, 효소 발색 반응으로 포획 항체에 붙은 항원 정량 확인

[ELISA] 효소결합면역흡착검사 End

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[Cloning] 생명 복제 Start

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생명 복제 (Cloning)

: 생명 복제란 생식세포복제 또는 체세포복제 등의 방법으로 유전 정보가 같은 생명체를 복제하는 것

*생식세포복제 - 수정란 분할을 이용한 복제

*체세포복제 - 성체 체세포에서 핵을 떼어 이를 착상

: 영국의 월머트 박사는 체세포 복제술을 이용해 복제양 '돌리'를 탄생시킴 (1996)

1. 생식세포복제 (Germ cell cloning)

: 생식세포복제란 난자와 정자가 결합한 수정란의 분할과정에 있는 난세포(할구)를 공여핵 세포로 이용하는 것

2. 체세포복제 (Somatic cell nuclear transfer;SCNT)

: 체세포복제는 체세포핵치환이라 불리며, 생식세포복제와 다르게 정자와 난자의 결합 과정이 없음

: 핵을 제거한 난자에 몸에서 떼어 낸 세포를 집어 넣어 동물을 복제하는 행위

: 포배기까지 키운 뒤 대리모의 자궁에 착상함

→태어난 개체는 핵을 공여한 개체와 모든 유전자가 동일

→체세포복제로 태어난 개체의 염색체는 텔로미어 길이가 정상에 비해 매우 짧음

[Cloning] 생명 복제 End

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[Mircoarray] DNA 미세배열 Start

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DNA microarray

: 마이크로어레이는 매우 작은 DNA 조각들이 고체 표면에 집적된 DNA Chip

: 대량 유전자의 발현 정도를 동시에 측정하여, 그룹 간의 유전자 발현 차이를 비교함

*세포에서 전사된 여러 mRNA의 발현 패턴을 분석

: 많은 표본을 동시에 실험하므로, 짧은 시간에 대량의 데이터를 얻을 수 있음

: Dye bias/스캐닝 불량/혼성화 문제 등의 여러 Systemic error를 가지므로 분석에서 보정 필요

Microarray 활용 분야

ㄱ) 신약 발견

ㄴ) 진단

ㄷ) 단백질체학

ㄹ) 기능유전체학

ㅁ) DNA 시퀀싱

ㅂ) 유전자 발현 동정

ㅅ) 독성유전체학

Microarray 실험 과정

1) 샘플 수집

- 유전자 발현을 확인할 Normal cell(정상) 및 Cancer cell(질병) 수집

2) mRNA 분리

- 페놀클로로포름과 같은 용매를 통해, 수집된 세포 파쇄물에서 RNA를 추출함

- 추출된 RNA에서 rRNA와 tRNA를 제거하고, mRNA만 남김

3) Labeled cDNA 생성

- 상보적인 cDNA(complementary DNA) 생성을 위해, mRNA의 역전사 반응 수행

- 정상과 질병을 구분할 수 있도록, 서로 다른 형광 표지를 사용

4) 혼성화(Hybridization)

- 합성된 cDNA들은 Chip 위에 뿌려져 혼성화 시작

- 결합되지 않은 서열들은 세척을 통해 제거됨

5) 기기 분석

- 마이크로어레이 스캐너로 cDNA 형광 이미지를 기록

- 각 스팟에 대한 형광 세기 차이에 따라, 유전자 발현 정도가 측정됨

*녹색: 정상

*빨간색: 위암

*노란색: 공통

[Mircoarray] DNA 미세배열 End

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[DNA sequencing] 생어 염기서열 분석 Start

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Sanger sequencing

: Sanger sequencing은 영국 생화학자 Fred Sanger(프레드 생어)와 그의 동료들이 1977년에 개발한 DNA 시퀀싱 방법

: 시험관 DNA 복제 중에 DNA 사슬을 종결시키는 'dideoxynucleotide termination method'에 기반

: 휴먼게놈프로젝트에서 상대적으로 작은 DNA 조각들을 시퀀싱하기 위해 사용됨

: 최근, NGS 분석으로 많이 대체 되었지만, 여전히 500bp 이상의 긴 염기서열 분석을 위해, cloning, PCR 분야 등에서 생어 시퀀싱 이용

Sanger sequencing 구성 요소

ㄱ) DNA template

→ 시퀀싱 될 DNA 주형

ㄴ) DNA 중합 효소(DNA polymerase enzyme)

→ DNA를 합성하며 연장해나감

ㄷ) 프라이머(Primer)

→ 방사성 표지 프라이머를 제작해, DNA Polymerase의 '스타터'로서 역할

ㄹ) 4개의 Deoxynucleotides(dNTP)

→ dATP, dTTP, dCTP, dGTP

ㅁ) 4개의 Dideoxynucleotides(ddNTP)

→ ddATP, ddTTP, ddCTP, ddGTP

→ ddNTP가 끼어들 때 복제를 멈추며, 다양한 길이의 DNA 가닥들이 합성됨

[DNA sequencing] 생어 염기서열 분석 End

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[Western blotting] 웨스턴 블로팅 Start

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Western blot (웨스턴 블롯)

: 웨스턴 블롯은 특정 샘플 내에서 단백질 유무 또는 양을 확인하기 위한 분석 방법

: 웨스턴 블롯은 단백질-단백질 사이의 상호작용에 기반

→ 서던 블롯: DNA-DNA

→ 노던 블롯: DNA-RNA

: 주로 항원-항체(Antigen-Antibody) 반응을 사용하기에 매우 높이 특이성을 가짐

→ 항원-항체 반응으로 타겟하는 특정 단백질을 검출

Western blot 실험 과정

1. 세포들을 파쇄한 후, 추출한 단백질을 SDS-PAGE 수행

*SDS-PAGE(Sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis): 단백질 질량 차이에 따른 분리 방법

2. 단백질을 겔에서 멤브레인 막으로 옮김

3. 블로킹 과정을 통해 코팅을 해주어, 불필요한 것들을 붙지 않게함

4. 1차 항체반응

*1차 항체는 찾고자 하는 단백질에 특이적으로 붙도록 디자인

5. 결합하지 않은 항체들을 씻어냄

6. 2차 항체반응

*2차 항체는 눈으로 확인하기 위해 사용됨

*2차 항체는 신호를 증폭시키는 효과 존재

7. 결합하지 않은 항체들을 씻어냄

8. 발색 반응을 일으켜서 밴드를 감별함

[Western blotting] 웨스턴 블로팅 End

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