[Gene cloning] 유전자클로닝

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1. 유전자클로닝 (DNA클로닝;유전자재조합기술)

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: 관심 있는 유전자 절편을 벡터에 삽입 후, 세포에 주입하여 발현시키는 유전자재조합 기술 (Recombinant DNA technology)

: 쉽게 말해, 타겟하는 유전자의 동일한 사본을 세포 내에 보관하고 증폭하는 기술

: 형질전환된 생물에서 특정 유전자를 발현시켜 유용한 물질을 대량 생산할 수 있음

→ 인간 인슐린 유전자를 E. coli 박테리아에서 발현시켜 당뇨병 환자를 위한 인슐린 대량 생산

2. 유전자클로닝 준비

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ㄱ) 제한효소 (Restriction enzyme)

- 타겟하는 특정 염기 서열을 인식하여, 인산다이에스터 결합(Phosphodiester linkage)을 끊는 효소

- 핵산내부가수분해효소(Endonuclease)

- 제한효소는 회문구조(Palindrome)이라는 특이 서열을 인식함

*점착성말단(Sticky end): 이중 가닥 중 한 가닥이 돌출된 형태

*무딘말단(Blunt end): 이중 가닥 전체가 수직으로 절단된 형태

ㄴ) DNA연결효소 (DNA Ligase)

- 인접한 DNA 사슬의 3′말단과 5′말단을 인산다이에스터 결합으로 연결하는 효소

- DNA의 복제/재조합 등에 관여

- 보조인자로 NAD 또는 ATP가 필요

ㄷ) 운반체 (Vector)

- 관심이 있는 DNA 절편을 세포에 도입하기 위한 매개체 DNA

- 일반적으로 플라스미드(Plasmid)를 사용

- 운반체가 되기 위한 조건

A. 복제원점: 복제가 될 수 있도록 복제원점 서열을 지님

B. 선택마커: 배지에서 살아길 필수 유전자를 지님 (암피실린내성유전자)

C. Multicloning site: 다양한 제한효소 인식 자리들의 염기 서열을 지님

3. 유전자클로닝 과정

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1) 유전자를 자르고 이어붙이기

- 관심 있는 유전자 서열을 PCR로 증폭함

- 제한효소를 통해, 벡터 플라스미드의 Multicloning site 확보

- DNA연결효소를 통해, 플라스미드와 타겟유전자 서열 연결

2) 박테리아 형질전환 및 선별

- 절편이 연결된 벡터 플라스미드를 박테리아에 주입 (형질전환)

*열충격(Heat shock), 전기천공법(Electroporation)

- 항생제가 놓인 고체배지에 박테리아를 뿌려서 플라스미드를 지닌 균주만 선택 (콜로니 선별)

3) 단백질(결과물) 대량 생산

- 플라스미드를 지닌 콜로니를 계속해서 성장시킴

- 성장한 박테리아는 주입된 유전자를 과발현하여 단백질 생산

*Gene → mRNA → Protein

# DNA cloning 과정

#Reference

1) https://www.scienceall.com/%EC%9C%A0%EC%A0%84%EC%9E%90%ED%81%B4%EB%A1%9C%EB%8B%9Dgene-cloning/

2) http://www.dynebio.co.kr/yc/bbs/download.php?bo_table=data1&wr_id=10&no=0

3) https://www.khanacademy.org/science/biology/biotech-dna-technology/dna-cloning-tutorial/a/overview-dna-cloning

4) https://www.researchgate.net/figure/Type-of-DNA-ends-generated-by-restriction-enzymes-Representative-examples-of-restriction_fig1_315873372

5) https://terms.naver.com/entry.nhn?docId=1592227&cid=50314&categoryId=50314

6) https://www.youtube.com/watch?v=MIfDx417SDs

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