[NGS] Target Enrichment(Capture) assay

[NGS] RNA sequencing Start.

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1. Target Enrichment(Capture) assay

- 시퀀싱 하기 전 특정 유전자 또는 기타 관심부위를 DNA 또는 cDNA 라이브러리로부터 분리 또는 그 빈도를 증가시키기 위한 방법.

- 간단히 표현하자면, DNA는 너무 작아서 시퀀싱하기 어렵기 때문에 증폭이라는 과정을 통해 시퀀싱할 정도로 사이즈를 불린다.

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# Target enrichment 과정이 NGS에서 어느 순서에 존재하느냐나는 아래 그림을 참고하자.

# Target enrichment 방법에는 주로 Amplicon(A: 엠플리콘)과 Hybridization(B: 하이브) 2가지가 흔하게 사용된다.

2. Amplicon-based assay (위 A그림)

→ PCR 증폭과정을 통해, 타깃 유전자 부분을 풍부하게(enrichment) 하는 방식.

→ forward primer와 reverse primer가 결합하는 위치 사이의 공간이 증폭.

→ 일반적으로 엑손 하나 혹은 하나의 엑손을 두 개로 타겟함.

→ 타깃 범위 혹은 유전자의 수/사이즈가 늘어날수록 primer 디자인이 쉽지 않음.

→ Turnaround time이 좀 더 짧고, 상대적으로 적은 양의 input DNA를 필요.

→ 작은 수의 유전자 패널에 대한 target sequencing에 유용하지만, 패널의 유전자 수가 많아지거나 exome sequencing을 수행하는 경우에는 비효과적.

→ 패널사이즈↓

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3. Hybridization capture-based assay (위 B그림)

→ 혼성화와 Biotin-Avidin 결합으로 골라내는 방식.

→ Hybridization: Probe가 상보적인 염기서열을 갖고 있는 DNA fragment에 결합.

→ Capture: Probe와 DNA fragment 혼성체는 magnetic bead에 채집

→ Enrichment: Magnetic은 자기장을 형성하여, probe 결합 fragment만을 골라냄.

→ 작은 사이즈의 target 부위에서부터 whole exome과 같이 큰 사이즈 부위까지 유효한 검사를 가능하게 하는 방식.

→ Amplicon 방식에 비해 검사 시간이 더 길고 더 많은 양의 input DNA가 필요.

→ 패널사이즈↑

CancerPanel (암패널)에 경우 엠플리콘 방식을 사용하는데,

엠플리콘의 높은 정확도와 빠른 Turnaround time의 특징들은 Customized panel 제작에 필수적이다.

#아래 그림 역시 엠플리콘과 하이브를 비교한 그림이다.

NGS 파이프라인 과정에서 Amplicon 데이터를 Picard를 사용해 De-duplication(중복리드없애주는과정)하는 실수를 범할 때가 있다.

엠플리콘 방식의 특징상 특정 엑손 영역 부위를 반복적으로 시퀀싱하도록 제작된 것이므로 리드중복의 오류라 볼 수 없다.

우리가 흔하게 알고 있는 일반적인 NGS 파이프라인은 일루미나 Hybridization에 기반하여 만든 것이기에,

엠플리콘 데이터 분석에서는 Tool이나 Parameter에 주의를 기울여야겠다.

[NGS] RNA sequencing End.

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