[NGS] Next Generation Sequencing

[NGS] Next Generation Sequencing Start.

BioinformaticsAndMe

1. NGS (Next Generation Sequencing), 차세대염기서열분석

- 유전체를 무수히 많은 조각으로 나눈 뒤 각각의 염기서열을 조합하여 유전체를 해독하는 분석방법.

- 기존 생어 염기서열 분석(Sanger sequencing)과 달리 많은 수의 DNA조각을 병렬로 처리하는 데 특징.

- 차세대 염기서열 분석의 등장으로 유전체 분석에 필요한 비용이 급격히 낮아져 많은 분야에서 다양하게 사용.

2. Sanger sequencing  vs  NGS

- Sanger sequencing (1세대)

→ 시험관 DNA 복제 중에 DNA 사슬을 마무리 하는 ddNTP가 DNA 중합효소에 의해 제한적으로 삽입된다는 원리에 기반.

- NGS (2세대부터: Illumina, Pacbio, Ion Torrent)

→ Cloning X

→ Amplification이 병렬적으로 수행

→ 3단계의 병렬 시퀀싱 (nucleotide addition → detection → washing)

3. Next Generation Sequencing 발전 흐름

- 2세대 : Illumina (PCR and Fluorescence 수행).

- 2.5세대 : Pacbio (no PCR), Ion Torrent (no Fluorescence).

→ Ion Torrent : 수소이온 발생에 따른 PH와 전위차를 감지, 가격이 싸나 에러율 높음.

→ 참고로 Ion Torrent 데이터는 기존의 전통적인 일루미나 생물정보학 분석방법을 그대로 적용하면 많은 수의 false positive 발생.

→ 따라서, 분석 시 써모피셔에서 제공하는 Torrent Suite Software(TSS, ion platform software) 사용하는 것을 추천.

- 3세대 : Oxford Nanopore (no PCR, no Fluorescence).

→ Oxford Nanopore : 염기서열이 구멍을 통과할 때, 전류 흐름을 방해하는 성질 이용. Long read를 시퀀싱하는 능력 (~1Mb).

4. NGS Library 종류

- NGS Library: 샘플의 염기서열이 NGS 장비에서 해독될 수 있는 형태 (염기서열을 잘게 자르고 Index가 붙여진 시퀀싱 준비상태)

- 기본 NGS 라이브러리

→ Single end

→ Paired end (1Kb 이하)

→ Mate-paired end (3Kb 이상) 

- Exome 라이브러리

→ Exon을 캡쳐하는 키트를 통해 Exon만을 시퀀싱 (휴먼 1샘플이 40만원 정도하는 듯).

- GBS (Genotyping by Sequencing) 라이브러리

→ 제한효소를 처리하여 유전체 서열에서 그 제한효소에 의해 잘리는 영역 주변의 서열만을 시퀀싱.

→ GBS 장점 : 가격이 싸고(15만원), 참조유전체가 없는 종에도 적용 가능.

→ 유전체 전체를 Sequencing 하지 않고 부분적으로 sequencing 하여 비용적인 부담을 줄임.

→ GBS 단점 : 모든 유전자가 포함되지 않을 수 있음.

- RNA-seq 라이브러리

→ Total RNA는 90% 이상의 rRNA를 포함하고, 제거해줘야 함. 아래와 같은 방법들로 RNA를 동정한다.

#Removing rRNA: mRNA, miRNA 등의 Whole Transcriptome 동정. 그러나, rRNA를  완벽히 제거하기는 어려움.

#Oligo-dT Enrichment: mRNA의 Poly(A)부분만을 캡쳐하여 mRNA만을 동정.

#Size selection: 상대적으로 사이즈가 작은 Small RNA에 집중하여 동정.

- 16S amplicon 라이브러리

→ 16S 리보솜 RNA의 서열을 비교하여 원핵생물을 동정.

→ 메타지놈 연구에 주로 사용 (Amplicon 영역 중 V3,V5 사용).

[NGS] Next Generation Sequencing End.

BioinformaticsAndMe